摘要：每（měi）天2次注射FSH，進行牛的超排必須處（chù）理得當，否則由於基層技術人員的誤操（cāo）作將提高超排失敗的可能性。我們設計了3個試驗，應用透明質酸為基礎的緩釋物（SRF）稀釋促卵泡素V，然後單（dān）次肌肉內（IM）注射肉牛（niú），進行超排效果的評估。試驗1，將奶牛分成3組（zǔ），進行每天2次的注射程序與2種注射（shè）方（fāng）法的對比研究；為期（qī）4天，每天2次（對照（zhào）組）的IM的（de）牛（n=6）的超（chāo）排反應，大於單次皮下（注射SC）SRF（n=6），而奶牛（n=6）單次（cì）IM的SRF的反應位於兩者之間。試驗2，比較單次IM注射程序（xù）中，兩種SRF的濃度（20mg/ml的透明質酸，100% 對比10mg/ml的透明質酸，50%）影響。結果黃體（CL）的平均數沒有顯著差異（yì）（P≥0.05），但總的卵子/胚胎數（P＜0.05）、受精（jīng）卵（P＜0.01）和可移植胚胎數（P＜0.001），100% SRF處理組（n=20）是優於50% SRF處理組（n=20）。試驗3，在紅色安格斯奶牛上對比（bǐ）單次IM 100% SRF 稀釋的（de）FSH效（xiào）果，與傳統的為期4天，每天2次的超排效果。CL的平均數（13.7±1.2 VS 13.8±1.2），總胚胎數（12.3±1.5 VS 13.7±1.2），受精卵（7.2±1.1 VS 8.4±1.4）和可移植（zhí）胚胎（4.9±0.8 VS 6.4±1.3），在對照組（n=29）和單次注射組（n=29）中沒（méi）有顯著差（chà）異。

1. 前言

肉牛超排處理的主（zhǔ）要目的是誘發更多的排卵，致使產生更（gèng）多的可移植胚胎和移植（zhí）後的更高（gāo）妊娠（shēn）率（lǜ）。然（rán）而，供體對於促性（xìng）腺激素（sù）的處理有很（hěn）大的變異（yì）性，其對胚胎移植也有主要的影響。最近對發情周期和卵泡（pào）波的研究進展表明，在卵泡波（bō）啟動的時（shí）候用激素處理將獲得較好的超排效果，卵（luǎn）泡波的同期啟動方法現在已有較優的設計。

供體（tǐ）牛的超排（pái）處理（lǐ）可以通過傳統的單次IM 孕馬血清促性腺（xiàn）激素（eCG），或者每日2次IM垂體提（tí）取物FSH來實（shí）現，孕馬血清促性腺激素是一種複雜的糖蛋白激素，其半（bàn）衰期（qī）為40小時，單次注射可（kě）引起超排；而FSH在奶牛體（tǐ）內的生物半衰期不足5小時，必須多次處理（lǐ）才能誘發超排。用垂體提取物每日2次的IM處理的超排反應優於（yú）每日（rì）1次的處理。因此，垂體衍生物激素的處理必須謹慎（shèn），否（fǒu）則（zé）由於錯誤（wù）處理貨注射將提（tí）高失敗的可能性，另外，每日兩（liǎng）次（cì）的處理將（jiāng）引起供體牛的過度應激，這將使得以後的（de）超排反應逐漸（jiàn）減弱。故簡單（dān）的卵泡超排程序將有望減少供體牛的超排處理費用，提高其反應能力，尤其對不易處理的動物而言。

用垂體粗提物（FSH-P），以（yǐ）明膠鹽為媒介稀釋後一次性快速注（zhù）射（shè）後的效果（guǒ）類似（sì）於每日（rì）兩次，共5天的超排程序，然（rán）而，這（zhè）單次注射的產生的可移植胚胎數非常少。其他人也用FSH氫氧化鋁（lǚ）凝膠或聚維酮製劑的，但其結果不穩定。然而，也有一個擔憂就是垂體提取物和這些集合物的超排，可能使得牛體內產（chǎn）生對FSH 的抗體物。

    單次注（zhù）射FSH程序將是傳統的每日（rì）2次（cì）處理（lǐ）程序的牛超排處理的選擇途徑之一，單次處理程序可能（néng）更加適用於缺少技術人員的牛（niú）場。在一（yī）項使用垂體純提取物，促卵泡（pào）素V超排研（yán）究中，單次皮下注射400mg NIH-FSH-P1肉用奶牛的媒介物，體況較（jiào）高（＞3/5）的牛的超排反應（yīng）與傳統的每日2次、共4天（tiān）的處理結果相似，然而，此結果在有較少皮下脂肪組織的荷斯（sī）坦奶牛上未能重複。在另一項荷斯坦奶牛的研究中，單次注射的FSH-V被分成2份，在處理的第一天皮下注射75%，48小時後注射剩餘的25%，而前列腺素是正常注射，超排反應與傳（chuán）統的4天處理程序沒有（yǒu）不同，促卵泡素V的單次皮下注射與牛的（de）體況和性情有關，更易接受超（chāo）排處理的牛將會得到更優的效果。

    一個可選用的穩定的單次FSH注射的超排反應應該（gāi）是將促卵泡素V和可生物（wù）降結合解的高分子（zǐ）聚合物相結合，來維持在幾天內穩定慢速（sù）的釋放（fàng）激素。有好幾種生物或合成的不同材料性質的聚合物可用於（yú）維持藥物的（de）緩慢釋放，這些物質是可降解的，對生物體組織沒有免（miǎn）疫反應，適合於在（zài）動物體內使用，其中一種就是以透明質酸為基礎的物質（SRF），在以前的研究中，就將促卵泡（pào）素（sù）V用SRF稀釋後單次注射進動物體（tǐ），可誘發超排反應。一係列的實驗設計-評估使用SRF稀釋的促卵泡（pào）素V單次IM後（hòu），肉（ròu）奶牛的超排反應（yīng），主要目的（de）是確定使用SRF稀釋後（hòu）的促卵泡素V單（dān）次注射的位點，對超排反應（yīng）的穩定性（試驗1）；比較兩種不同濃度的SRF的IM注射結果（實驗2）；在安格斯奶牛上，比較注射SRF稀釋（shì）後促卵泡（pào）素V和注射每日（rì）兩次的生理鹽水，證實前者誘（yòu）發超排反應的（de）能力。

2. 材料與方法

實驗1是用SRF稀釋後（hòu）的促卵泡激素V注射不同（tóng）位點的（de）比較，雜種肉用奶牛（n=18）被隨機的分成3組，在第0天（開始（shǐ）處（chù）理天（tiān）），所有的奶牛注射5mg  17β-雌二醇和50mg孕激素，並植入含（hán）1.56g 孕激素的陰道栓，在第4天，按以下處理進行奶牛的超排處理：第一組（對照組）：用生理鹽水稀釋400mg的 NIH-FSH-P1，每（měi）天2次頸部IM注射（shè）逐漸遞減注射4天（80，80,60,60,40,40,20,20）；第二組：用10ml的SRF（20mg/ml 透明質酸）稀釋400mg的 NIH-FSH-P1頸部IM注射； 第三組：在用10ml的SRF稀釋400mg的 NIH-FSH-P1耳部皮下（SC）注射。對於單次注射，是先將促（cù）卵泡素V用（yòng）1ml的生理鹽水稀釋，然後注射進含有9ml、濃度為（wéi）22mg/ml 的透（tòu）明質酸的小瓶中，輕微搖勻，並吸進12ml的注射器（qì）中進行注射（shè）。在第6天的早上（shàng）和下午（FSH開始處理後的48小時），所有牛注射150mg PGF，並在下午撤栓。在第8天的早上注射12.5mg的LH，並在12和24小時後進行輸（shū）精。如果奶牛在第7天下午穩定（dìng）接受爬跨，12小時後進（jìn）行LH的注射和輸（shū）精，在第15天非手術法收集胚胎，並按照IETS的方法評估質量，IETS評估質量為1和2級的胚（pēi）胎則認為是可移植的胚胎。

實驗2是比較2種不同（tóng）SRF濃度通過單次IM注射促卵泡素V後超排反應，實驗分2階段進（jìn）行處理，第（dì）一階段，15頭紅色（sè）安格斯奶牛按交叉設計進行兩（liǎng）次超（chāo）排處理，第二階段（duàn），10頭紅色安格斯奶牛隨機分成兩組，進行一次超排處理，在第4天時，按照實驗（yàn）1的單次處理程（chéng）序用400mg的NIH-FSH-P1進（jìn）行頸部IM注射，單次注射的試劑是將促卵泡素N的凍幹粉（fěn）末用1ml的生理鹽水稀釋，然後在12ml的注射器中與9ml的（de）SRF（22mg/ml 透明質（zhì）酸，100%溶液（yè））或者50%的SRF稀釋（11mg/ml 透明質酸，50%溶液）在處理前混（hún）勻。輸精、胚胎采集和評（píng）估均按照實驗1的進行處理。

實驗3是證實（shí）前麵的結果（guǒ），並比較（jiào）用100%的SRF稀釋的促卵泡素V的單次（cì）IM注射和傳統的生理鹽水稀釋的促卵（luǎn）泡（pào）素V的每（měi）日（rì）2次的IM注射對紅色安格斯供體奶牛的超排影響，實驗分兩個階段：第（dì）1階段，17頭紅色（sè）安格斯奶牛按交叉設計進行兩次超排（pái）處理，第二階段，24頭紅色安格斯（sī）奶牛隨機分成兩（liǎng）組，進行一次超排處理，在第4天時，按照（zhào）實驗1的用400mg的NIH-FSH-P1按每日兩（liǎng）次為期4天（tiān）的遞（dì）減或按（àn）單次進行頸部IM注（zhù）射，單次注射的試劑是將促卵泡素N的凍幹粉末用1ml的生（shēng）理鹽水稀釋，然後在12ml的（de）注射器中與9ml的SRF（22mg/ml 透明質酸，100%溶（róng）液（yè））在處理前混勻（yún），同實驗2。輸精、胚胎采集（jí）和（hé）評估均按照實驗1的進行處理（lǐ）。

2.1 超聲波

所（suǒ）有的奶（nǎi）牛在第0羞羞视频免费观看第4天檢查（chá）黃體的存在，卵泡的大小和數量，奶牛的卵巢在超排處理期間（4-8天），每天都進行卵泡生長特性的超聲波（bō）檢測，在11天檢測排卵數（shù）量，在15天通過直（zhí）腸檢查黃體數量來證實超排反應。

2.2 統計分析

實驗1中的（de）數據（連續的狀態分布和變異）按ANOVA進行評估，平均數通過LSD測（cè）試進（jìn）行比較，實驗2和（hé）3的（de）數（shù）據通過平方根被初步轉（zhuǎn）化，然後使用Infostat進行ANOVA分析，通過保護LSD測試進行平均（jun1）數的比較，ANOVA混合模式檢測（cè）天數、處理和天（tiān）數與處理互作對≥9mm卵泡直徑和數量的（de）影響，處理組間平均卵泡直徑的統計比較、每頭（tóu）牛的平均卵泡直徑在卵巢上出現大於3mm的卵泡時開始進行測（cè）試。

3. 結果

    實驗1的結果如表1所示，總胚胎數、受精卵（luǎn）和可移（yí）植胚胎數，用400mg FSH按（àn）每日2次為（wéi）期4天的IM注射比按（àn）400mg  FSH單（dān）次耳部（bù）SC注射效（xiào）果顯著好（P＜0.05）。而用單次IM注射後獲得的總胚（pēi）胎數、受精卵和可移植（zhí）胚胎數處於中間水平，與其它（tā）處（chù）理組間沒顯著差異。圖（tú）1表示了在超排（pái）處理期間直徑≥9mm的（de）平均卵泡數。在所有的處理組中（zhōng），直徑≥9mm的平（píng）均（jun1）卵（luǎn）泡（pào）數在第5-8天時增加（即（jí）在第一次FSH處理後的24小時），此後則減少（天的影響，P＜0.001），此外，在6-8天，用每日2次IM注射促卵泡素V的方法，將有更多的≥9mm的卵泡生成。

    在試驗2，在第1和（hé）2階（jiē）段（duàn）之間，沒有（yǒu）差異，所以將數據（jù）結合在一起。盡管CL的平（píng）均數沒有顯（xiǎn）著的差異，但總（zǒng）的卵子（zǐ）/胚胎數（P＜0.05）、受（shòu）精卵（P＜0.01）和（hé）可移植胚胎數（P＜0.001）用100% SRF溶液的比50% 的要好的多（表2）。在胚胎采集時，50%SRF組中的2頭牛和（hé）100%中的（de）1頭牛，其黃體（tǐ）數小於2；此外，50%SRF組中20頭牛裏的8頭奶牛（40%）沒有產生任何可移植的胚胎，而100%組中的所有奶牛都（dōu）產生了至少一枚可移植（zhí）胚胎。

在處理期（qī）間卵（luǎn）泡的（de）特（tè）性沒有什（shí）麽不同，在注射促卵泡素V的當天直徑在（zài）3-5mm的卵（luǎn）泡（pào）數（第4天； 18.6±1.5 VS 16.4±1.6），排卵數（13.2±1.1 VS 10.4±1.4），LH處理後的平均排卵時間（30.8±1.3h VS 30.1±2.6h）在100%SRF 稀釋組和50%稀釋組組間沒有顯著差異，然而，所有直徑＞3mm（P=0.0662；圖2）和≥9mm（P=0.08994；圖3）的卵泡在處理期間都（dōu）傾向有時間和處理之間的互作作用，使得在第7羞羞视频免费观看第8天，用100% SRF 稀釋的促卵泡素組比50%的組有更大的平均卵泡直徑值（圖2）和≥9mm的卵（luǎn）泡數（圖3）。

在（zài）試驗3中（zhōng），在第1和2階段之間，沒有差異，所以將（jiāng）數據結合在一（yī）起。CL的數量、總胚胎數、受精卵數和可移植胚胎數（shù）在組（zǔ）間沒有差異（P＞0.05；表3）。在胚胎采集時，每組各有1頭牛其黃體數≤2，對照組中有1頭和單次注（zhù）射組中有2頭奶牛沒產（chǎn）生任何可（kě）移（yí）植胚胎（tāi）。

在處理期間組間（jiān）卵泡特性（xìng）沒有什麽差異，所有直徑≥3mm（圖2）的卵泡的（de）平均直徑，直徑在（zài）3-5mm、6-8mm和（hé）≥9mm的卵泡數都受到天數的影（yǐng）響（P＜0.001），但是組間沒有顯著的差（chà）異，也沒有互作影（yǐng）響。此外，在注射促卵泡素V的當天直徑在3-5mm的卵泡數（第（dì）4天；19.6 ± 1.5 VS 17.6  ±  1.3)，排卵數  (15.8±1.3  VS 14.5 ±1.7)  LH處理後（hòu）的平均排卵時間 (31.3± 2.3 h  VS  35.1 ± 2.3 h)，在對照（zhào）組和單次（cì）注射組之間沒（méi）有顯著差異。

4 討論

總的結果顯示，用20mg/ml的透明質酸（100%的SRF溶液）稀釋促卵泡素（sù）V，並進行單次IM注射後（hòu），對（duì）紅安格斯供體牛有更好（hǎo）的超排（pái）效（xiào）果，在產生的胚胎總數和可移植胚胎數上（shàng），與傳（chuán）統的每日2次的IM注射的效果沒有顯著（zhe）差異。值（zhí）得注（zhù）意的是在實驗2和3中，49頭牛用100% SRF稀釋促卵泡素V後進行單次注射後（hòu），僅有4頭（8%）沒產生任何可移植胚胎，這比以前報道的相關肉牛（24%）和荷斯坦奶（nǎi）牛的每日兩次IM注射的數值要小。實際上（shàng），在實驗3中，每日兩次IM注射的29頭（tóu）超排牛對照組中，僅有3頭（10%）沒有產生（shēng）可移植胚胎，顯然和單次IM注射的超排（pái）反應組之間（jiān）沒有（yǒu）差（chà）異。

注射後血液中的FSH濃度，由於處理吸收位點和代謝清除的不同而異，按照代謝率，預（yù）測FSH以相同的速率被清除，而無論處理的方法和濃（nóng）度如何。垂體提取物的快速吸收將（jiāng）導致其清除的速率加快，因（yīn）此，卵泡在較大濃度的（de）FSH的生長時間減少，不能維持在排卵前。以前的文獻結果顯（xiǎn）示，促卵泡素V生（shēng）理鹽水稀釋、並在單次IM或SC注射後（瘦肉型動物（wù）），血液中FSH達到相似（sì）的高濃（nóng）度，並比體況較好接受了單次SC注射的奶牛體內的FSH下（xià）降更快，推測是由於體況好的奶（nǎi）牛吸收較慢的原因。將FSH用聚乙烯比咯烷酮（tóng）稀釋，比對照的生理鹽水（shuǐ）稀釋將導致其吸收更慢、時間更長、血液中FSH濃（nóng）度更高。我（wǒ）們推斷將促卵泡素（sù）V和透明（míng）質酸混（hún）合也將（jiāng）減緩吸收速度，維持血液中FSH的較高水平，因此，在單次注射促卵泡素（sù）V誘發超排反應中，FSH的吸收速率是影響因素，而不是清楚的速率。

試驗（yàn）1的結果顯示，將促卵泡素V和透明質酸混合單次SC耳（ěr）部注射，沒有產生較好的效果，但單次的IM注射（shè）和目前已接受的每日2次的生理（lǐ）鹽水稀釋的處理效果沒（méi）有顯著的差異（盡管在數值上小一（yī）點），然而，將促卵泡素V和透明質（zhì）酸混合的方法將值得參考，20mg/ml的透明質酸（100% SRF）溶液是非常粘稠的，其混合（hé）促卵泡素V後是可以觀察的到的，所以不可能從小瓶中完全的抽吸（xī）出來，因此推斷單次（cì）IM注射後較低的超排反應可能是（shì）由於FSH比原計（jì）劃（huá）的劑量小（xiǎo）的（de）緣故，此推論從卵泡的（de）生殖特（tè）性上可證實，盡管在激素處理開始時，起初（chū）的卵泡（3-5mm）數量沒有差異，而達到（dào）9mm或更大直徑的在單（dān）次注射組是較少（shǎo）的（圖（tú）1），故比促卵泡素（sù）V和20mg/ml的透明（míng）質酸（suān）混（hún）合的方（fāng）法外（wài），還需探索一種更易吸（xī）取的方法，這也是我（wǒ）們在實驗其（qí）中使用較低（dī）濃度（10mg/ml透明質酸；50% SRF）的（de）透明質酸的原因，50% SRF溶液不是（shì）十分粘稠故更容易從小瓶中吸取。

在實驗2和3中，在注射器（qì）內混合生理鹽水中的促（cù）卵泡素V和SRF溶（róng）液，對超排反應更（gèng）加有效。然（rán）而，50%的SRF溶液比100%的超排效果不佳，在實驗2中，卵泡的直徑特（tè）性顯示用50%的SRF溶解促卵泡素V可誘發（fā）超排反應，但卵泡的生長似乎在延遲2天後（第6天；圖2），比100% SRF組（圖3）出（chū）現了較少的能達到排卵大小的卵泡，推測是由於在後半部分處理時，FSH不足的原因，正如以（yǐ）前在荷斯坦奶牛（niú）上用生（shēng）理鹽水稀釋的促卵泡素V皮下處理的效果（guǒ）一樣。

在實驗（yàn）3中，與傳統的（de）每日2次共4天的IM注射程序相比（bǐ）較，應用20mg/ml的透明質酸（100% SRF）稀釋促卵泡激素V後（hòu）單次IM注射（shè）的效果也非常有效（xiào）。在（zài）各測試的項目上，兩組間沒有顯著的差異，與以前文獻中報道的每日2次處理程序後的可移植胚胎數相比，其數量很高。值（zhí）得（dé）注（zhù）意的是在（zài）處（chù）理初期，對FSH易反應（yīng）的卵泡（直徑為3-5mm）數量在兩組（zǔ）間沒有差（chà）異，事實上（shàng），對照組的數量還占優。另外，兩組間的排卵數和LH處理後到排卵的時間間隔上都沒有差異，兩組間無差異（yì）的卵泡生長（zhǎng）特性顯示了單次IM注射（shè）促卵泡素V可為卵泡的生長至排卵（luǎn）階段提供（gòng）充足的FSH。

實驗3是一個用透明質酸稀釋促卵泡激（jī）素V後單次注射誘發（fā）奶牛超排反應的相當嚴謹的測試，相比於傳統的每日2次的IM注射（shè）模式，此測試不僅證實卵泡生（shēng）長特性，而且在（zài）測試的各變量間，包括排卵率、胚胎產量和更（gèng）主要的可移植胚胎數都沒有差異，盡管單（dān）次IM注射處理中（zhōng）的最佳促卵泡素V的劑量沒有被測試，但這與每日2次（cì）注射的劑量（liàng）相似，也和以前報（bào）道的單次（cì）促卵泡素SC注射的（de）劑量相近。

5. 結論

    總的概括，相比於傳統（tǒng）的每（měi）日2次的IM注射處理程序，用20mg/ml的（de）透明質酸稀釋的促（cù）卵泡素V單次注射後的紅安格斯供體奶牛的超排（pái）反應也是較好的，對於混合促卵泡（pào）素和（hé）透明質酸（suān）的方法將是可行的（de），但對於安格斯牛所使（shǐ）用的這一劑量是（shì）否最優還不太清楚，促卵泡素V的單次肌肉內注射將減少超排處理中的勞（láo）動強度和處理程序，特別是對於（yú）難以進行超排處（chù）理操作的動（dòng）物而言，此方法將更加適用。